En esta actividad, tras
preguntarnos como podíamos simplificar la técnica para determinar el número de
células que tenemos en cada momento del cultivo, hemos desarrollado un método
por colorimetría para determinar la concentración de algas.
Hasta ahora el seguimiento de
cultivo lo hemos hecho contando el número de células bajo el microscopio con
una cámara de Neubauer, este método además de consumir tiempo, precisa de un
periodo de entrenamiento hasta lograr precisión en el conteo. Por esta razón, nos
planteamos encontrar una forma más rápida y con suficiente precisión.
Nos pusimos manos a la obra y
desarrollamos el siguiente método.
Objetivo: Determinar si existe una correlación entre la
absorbancia de una muestra de algas y la concentración de estas previamente
establecida con cámara de Neubauer.
Hipótesis: El
pigmento mayoritario en nuestro cultivo de algas es la clorofila, que tiñe de
color verde los cultivos.
Nuestra hipótesis es que a medida
que aumenta la concentración de algas en cultivo también lo hará la cantidad de
pigmento verde y, por tanto, la intensidad del color. Pensamos que podemos
medir este incremento con un colorímetro (midiendo el incremento de absorbancia
a 565 nm- verde) y posteriormente verificar la correlación entre la absorbancia
y la concentración de células en muestras con una concentración de algas
conocida (contadas con la cámara de Neubauer). Si verificamos la hipótesis lo
único que deberíamos hacer para saber la concentración de células en cultivo es
una lectura de la absorbancia con el colorímetro, procedimiento más rápido y
sencillo que contar células con el microscopio.
Procedimiento:
1.
Prepararemos una batería de diluciones
seriadas de nuestra muestra de algas con un factor de dilución de ½ (1
parte de soluto por cada 2 de disolución) y un volumen final de 4 mL.
Para ello
seguiremos los siguientes pasos:
a)
Colocar 5 tubos en una gradilla y rotularlos.
b)
Calculamos el volumen de paso de acuerdo a la
siguiente fórmula:
Volumen de paso= Volumen final/ disolución
-1
En nuestro caso será:
Volumen de paso= 6mL/2-1= 6 mL de volumen
de paso
c)
Pipeteamos en el primer tubo, 6 mL de muestra
madre, más otros 6 mL de muestra madre que se corresponden con el volumen de
paso, en total, pipetear 12 mL de muestra madre.
d)
En los tubos 2, 3, 4 y 5 pipetear en cada uno, 6 mL de agua destilada.
e)
Iremos pasando 6 mL de un tubo a otro.
Comenzamos sacando 6 mL del tubo 1, que solo contiene solución madre, y los
pasamos al tubo 2, mezclamos para homogenizar el tubo 2 y, con la pipeta
limpia, pipeteamos 6 mL del tubo 2 al tubo 3.
f)
Repetimos el proceso hasta llegar al último
tubo, tubo 5, al que le pondremos 6 mL procedentes del tubo 4. En este caso el
tubo 5 tendrá 12 mL, por lo que para igualar volúmenes, lo agitamos y
desechamos 6 mL.
2.
Lectura en el colorímetro.
a)
Conectamos el colorímetro al ordenador y
abrimos el Sparkview.
Para hacerlo conectamos el colorímetro a la interface
y a continuación al ordenador. Abrimos el programa Sparkview, seleccionamos el
sensor y creamos un nuevo experimento. Seleccionamos la absorbancia y la
transmitancia para el color verde (565 nm).
b)
Calibración.
No es necesario calibrar siempre que se usa el
colorímetro, pero si es recomendable para obtener mayor precisión.
Para calibrar:
·
Rellenar la cubeta con agua destilada (6 mL) y
enroscar el tapón.
·
Colocar la cubeta en el colorímetro y cerrar la
tapa
·
Presionar el botón de calibración del sensor. Se
encenderá una luz para indicar que la calibración está en proceso.
·
Espera hasta que la luz se apague y saca la
muestra.
c)
Preparación de la muestra y lectura.
·
Filtramos la muestra con malla de plancton para
eliminar partículas en suspensión.
·
Rellenamos la cubeta con 6 mL de muestra
procedente del tubo 1.
·
Enroscamos la tapa, limpiamos el vidrio de la
cubeta con un papel suave. Evita tocar el cristal.
·
Movemos suavemente para mezclar evitando hacerlo
bruscamente, pues se pueden formar burbujas en la muestra.
·
Ponemos la cubeta en el colorímetro, cerramos la
tapa y hacemos click en el botón start para comenzar la lectura.
·
Retiramos la muestra, colocamos la otra cubeta
con la muestra del tubo 2, hacemos la lectura. Repetimos el proceso hasta
terminar las lecturas.
*Nota: si se utiliza la misma cubeta para todas
las lecturas de la batería de dilución, hay que lavarla y enjuagarla con agua
destilada entre lecturas.
La tablet utilizada
para la captura de datos está conectada al data logger y al sensor para
colorimetría, el programa Sparkview, permite registrar de forma automática las
medidas de absorbancia. Elegimos la captura de datos en forma de tabla por su
facilidad para ser exportados a Excel, donde realizamos las gráficas y los
cálculos estadísticos.
Resultados.
Los resultados muestran una buena
correlación entre la concentración de algas (tubos) y la absorbancia para el
verde medida a 565 nm.
|
TUBOS
|
Absorbancia
(nm) Grupo L y A
|
Absorbancia
(nm)
Grupo R y H
|
Absorbancia
(nm)
Grupo A y E
|
Absorbancia
Media
|
Desviación
Standard
|
|
Tubo 1.
|
0,040
|
0,048
|
0,028
|
0,039
|
0,0057
|
|
Tubo 2.
|
0,0718
|
0,095
|
0,0588
|
0,075
|
0,0164
|
|
Tubo 3.
|
0,1272
|
0,2018
|
0,1144
|
0,148
|
0,0528
|
|
Tubo 4.
|
0,2188
|
0,2186
|
0,2072
|
0,215
|
0,0001
|
|
Tubo 5.
|
0,4142
|
0,423
|
0,4084
|
0,415
|
0,0062
|
En la gráfica se muestra en líneas
punteadas la recta de regresión, en la parte superior la ecuación de la recta
que mejor se ajusta y el valor del coeficiente de correlación. Los puntos se
corresponden con los valores medios de absorbancia de las distintas
concentraciones de algas y las barras indican la dispersión de datos respecto a
la media, medido como desviación standard.
Conclusión.
El coeficiente de correlación
indica una buena correlación (r2= 0,909) entre la concentración de
algas y la absorbancia a 565nm (verde), lo cual permite utilizar este método
para determinar de forma rápida y cómoda las concentraciones de algas en las
distintas fases del cultivo.
La ecuación de la recta que mejor se ajusta a nuestros datos es y= 0,0885 X - 0,082.
Filtramos con la malla de plancton un1,5 L de agua. En los próximos días observaremos los microorganismos presentes en el agua.
